也谈大分子生物分析中非 BSA 封闭液的重要性

在大分子生物分析实践中，封闭液的性能，决定着分析方法的特异性、灵敏度、回收率 等关键指标，但往往被方法开发者所忽视。本文作者结合自身 30 余年的免疫分析经验， 在 总结传统封闭剂特点的基础上， 揭示封闭剂本身应该具备的性质特点，创制了非糖基化小分子量蛋白质封闭剂， 借此小文和各位生物分析同仁交流探讨。

一、封闭的目的

ELISA 实验中，封闭的目的有两个， 一是填补板子上未被包被蛋白占用的空白位点， 降低 后续 ELISA 操作过程中的非特异性吸附。二是利用填缝灌浆原理，减弱分子振动， 增加包被

蛋白的抗水解， 抗氧化能力，提高包被蛋白的稳定性。

二、 理想的封闭剂应该具备的特点

第一，封闭剂的分子量要小于包被蛋白，这样利于填充分子间隙及减小空间位阻。第二， 封闭剂本身疏水性不能太强，以降低后续 ELISA 操作的非特异性吸附。第三，在 ELISA 体系 的 buffer 条件下，不能与酶标结合物形成离子键，防止提升本底。所以，糖蛋白作为封闭剂 是不合适的，因为，在某些 ELISA 体系下，由于羟基的存在，糖蛋白会带有大量负离子，和样本中的杂抗体或者酶标抗体带的正离子相互吸引，导致本底信号增高。

三、常用封闭剂的优缺点对比

1 、BSA 封闭剂

BSA 是经典流传， 广泛应用的封闭剂，却不是最合适的封闭剂。在组成 BSA 的 545 个氨 基酸中，非极性氨基酸有 251 个，占比 46%。这些非极性相对疏水的氨基酸使得 BSA 很容 易封闭到包被板上去，但同时也增加了包被板的疏水性，在整个 ELISA 的操作过程中，待测 样本中的杂质或后续的酶标结合物容易非特异性吸附到板子上去，本底不降反升， 信噪比降低，从而使 ELISA 分析方法的功效率严重降低。

表一 BSA  的氨基酸组成

2、干酪素

干酪素封闭剂的优势是本底较干净， 但通常具有较大的分子量，形成严重的空间位阻，从而影响抗原抗体反应， 在灵敏度要求比较高时， 不易使用。

3、动物血清

小牛血清或山羊血清等动物血清用作封闭剂，本底亦较干净， 但缺点也是明显的， 一是 封闭后板子的稳定性不好，二是内源性生物素影响 avidin-biotin 检测系统，三是含磷酸化蛋白，某些场景不适用。

4 、常见封闭剂优缺点对比

表二  常见封闭剂性能对比

四、创新型非糖基化低疏水性蛋白封闭剂的特点

为弥补现行封闭剂的不足，降低 ELISA  分析方法开发的难度，北京新艾进生物科技有限 公司的 ELISA 研究专家，历经数年研究，反复验证，反复改进，最终，重组表达了一种新型 封闭剂蛋白，该封闭剂蛋白无糖基化，极性氨基酸和非极性氨基酸达到最佳平衡，分子量兼 顾绝大多数包被蛋白，既能高效封闭板子包被后的空白位点，又能极显著降低 ELISA 后续过 程的非特异性吸附， 增加 ELISA 检测信号的信噪比，提升检测的灵敏度。以此封闭蛋白为核心， 研制出了 outblock 封闭液。

五、 OUTBLOCK封闭液的优势

outblock 显著提高 ELISA 分析方法的信噪比，相比于进口 super 超级封闭液，对于封闭糖 基化包被抗原， 降低人血样本的本底，提高临床生物分析的特异性，具有碾压性优势。而且同样是短时高效封闭液。

六、 OUTBLOCK验证数据

1 、 糖基化 PD1 蛋白包被 板子，检测人血中抗 PD1 单抗， detection 为羊抗人-HRP

简要： 抗 PD1 单抗的 PK 临床生物分析， 包被糖基化的 PD1 抗原蛋白， detection 为 羊抗人 IgG-HRP，由于人血清中正常 IgG 的干扰，容易出现低值假阳性， 用 outblock 封闭， 高效消除正常 IgG 的干扰。

表三 1%BSA PBST   、superblock  、 outblock 数据对比（MRD 1：20）

小结：所有操作步骤一致的情况下Outblock 信噪比显著高于1%BSA PBST 和superblock，明显提升临床生物分析的特异性和灵敏度。

2 、 糖基化 vegf 蛋白包被板子，检测人血中抗 vegf 单抗，detection 为羊抗人-HRP

简要： 抗 VEGF 单抗的 PK  临床生物分析， 包被糖基化的 VEGF 抗原蛋白，detection 为羊抗人 IgG-HRP，由于人血清中正常 IgG 的干扰，容易出现低值假阳性，用 outblock 封闭， 消除正常 IgG 的干扰。

表四 抗 VEGF 单抗临床 PK 分析， superblock AND outblock 数据对比（MRD 1：20）

小结： 所有操作步骤一致的情况下， Outblock 信噪比显著高于 super 封闭剂。

3 、 鼠 抗 nanoAb   包 被 ， 检 测 猴 血 中 nanoAb ， detection   为 生 物 素 化 鼠 抗 nanoAb,SA-HRP+TMB 指示信号

表五 纳米抗体临床前 PK 分析， super 封闭剂和 outblock 数据对比（MRD 1：20）

小结： 猴血样本纳米抗体 PK 分析时， Outblock 与 superblock 无显著差异，但 outblock 具有成本优势。

4 、 鼠抗 A01 激素 MAb 包被，检测肌肉组织提取液中 A01 ，detection 为生物素化鼠抗A01 MAb,SA-HRP+TMB 指示信号

表六 某激素药临床前 PK 分析， 肌肉样本，MRD1：10

小结： 对于肌肉组织样本，Outblock  比 superblock  本底显著降低，分析灵敏度显著提升。

5 、 B020 蛋白药 PK 分析，在 MSD 平台上对比 outblock 和 super 封闭液

表七 MSD 平台上对比 super 封闭液和 outblock 封闭液

小结： 在 MSD 平台上， 某蛋白药 PK 分析，两种封闭液信号无显著差异。

6 、 封闭时间对比

简要：包被糖基化的 EGFR 抗原蛋白，检测人血中抗 EGFR 单抗，detection 为羊抗人IgG-HRP，考查 outblock 不同封闭时间的效果， super 封闭液作对照。