rBSA Promoter在免疫检测试剂中的应用研究

在免疫诊断试剂的反应体系中，抗原抗体反应时所处的微环境对免疫检测试剂的性能有重要影响，其中反应体系的伴随蛋白是影响分析方法特异性、灵敏度的关键因素之一。传统的广泛应用的伴随蛋白是天然牛血清白蛋白（BSA），但由于天然的 BSA 含有较多非极性氨基酸，具有很强的疏水键形成能力，所以，容易和样本中的杂质、 capture 蛋白、detection 蛋白形成非特异性吸附，从而产生较高的本底信号，严重降低了检测方法的信噪比（SNR）。为了降低本底信号，研究者们有时用小牛血情、山羊血清代替 BSA，或者添加各种表面活性剂，但这些操作在降低本底的同时，也不同程度地降低了真阳性的响应信号值，并不能有效提升免疫检测试剂的性能。免疫诊断试剂的研究者们一直在努力寻找一种既能有效降低本底，又能增强抗原抗体反应强度的伴随蛋白，直到 rBSA Promoter 的出现，人们终于找到了有效解决这一矛盾的方法。

rBSA Promoter 是一种重组蛋白，专为免疫检测技术而设计，是对 BSA 的重组改造，其极性亲水性氨基酸占比高达 95%，而氨基酸组成及蛋白结构的改变，使含有 rBSA Promoter 的免疫检测体系在降低本底的同时，有效促进抗原抗体的结合反应，显著增大信噪比，提高免疫检测试剂的质量。

 

一、  抗原抗体结合原理

根据大学课本上的知识描述，抗原抗体的结合力，有以下四种：

1、氢键作用

2、疏水键作用

3、离子键作用

4、范德华力作用

 

二、rBSA Promoter 设计原理

范德华力是个什么鬼东西，一直没有搞明白。而 rBSA Promoter 的设计原理如下：

1、协助抗原抗体形成氢键

2、封闭固相化蛋白的疏水基团

 

三、rBSA Promoter 的特点

1、显著提升抗原抗体的结合能力

2、显著降低本底噪音信号

3、和 BSA 相比，具有更好的稳定抗原抗体的能力

4、兼顾绝大多数抗体抗原蛋白的反应特点

 

四、rBSA Promoter 的应用 CASE

（一）间接法检测人血清中抗 VEGF 抗体（ACL 化学发光平台）

1、试剂材料

（1）SA-磁珠

（2）生物素化 VEGF 抗原

（3）鼠抗人 IgG-ABEI 示踪物

（4）空白人血清

（5）抗 VEGF 标准品:0.05ng/ml  2ng/ml

2、仪器：全自动分子发光生物免疫分析仪（rightflare60pro）

3、方法与过程

（1）分别用 1%BSA 和 rBSA promoter 工作液作为反应 buffer，用两种 buffer 各自稀释 SA 磁珠、VEGF-biotin、鼠抗人 IgG-ABEI、样本，上机测试。

（2）反应流程：

1）SA-磁珠+样本+VEGF-biotin，反应 10 分钟

2）洗涤

3）加鼠抗人 IgG-ABEI，反应 5 分钟

4）洗涤

5）读发光值

4、结果

 

Indicator	1%BSAsystem (RLU)	rBSA Promoter(RLU)
Blank(normal serum mixture）	850	350
Individual1	760	346
Individual2	989	342
Individual3	1006	319
0.05ng/ml pos S/blank	848 0.99	702 2.00
2ng/ml pos S/blank	16115 18.95	29008 82.88

5、小结

（1）在亲和素生物素参与的间接法检测人血样本实验中，rBSA Promoter 能高效去除人血中正常 IgG 的非特异性吸附，显著降低本底噪音。

（2）rBSA Promoter 能显著促进抗原抗体反应，增加阳性响应值，提高信噪比。

 

（二）间接法检测人血清中抗 PD1 抗体（ACL 化学发光平台）

1、试剂材料

（1）SA-磁珠

（2）生物素化 PD1 抗原：PD1-biotin

（3）鼠抗人 IgG-ABEI 示踪物

（4）空白人血清

（5）抗 PD1 标准品：0.1ng/ml；0.2ng/ml；0.4 ng/ml； 400 ng/ml； 800 ng/ml。

2、仪器：全自动分子发光生物免疫分析仪（rightflare60pro）

3、方法与过程

（1）分别用 1%BSA 和 rBSA promoter 工作液作为反应 buffer，用两种 buffer 各自稀释 SA 磁珠、PD1-biotin、鼠抗人 IgG-ABEI、样本，上机测试。

（2）反应流程：

1）SA-磁珠+样本+PD1-biotin，反应 10 分钟

2）洗涤

3）加鼠抗人 IgG-ABEI，反应 5 分钟

4）洗涤

5）读发光值

4、结果

 

Indicator	1%BSAsystem(RLU)	rBSA Promoter(RLU)
Blank(normal serum mixture）	1040	485
0.1ng/ml pos S/blank	1041 1.00	765 1.57
0.2ng/ml pos S/blank	1146 1.10	1148 2.36
0.4ng/ml pos S/blank	1385 1.33	2123 4.37
400ng/ml pos S/blank	64000 61.53	160000 329.89
800ng/ml pos S/blank	110600 106.34	289000 595.87

5、小结

（1）在亲和素生物素参与的间接法检测人血样本实验中，rBSA Promoter 能高效去除人血中正常 IgG 的非特异性吸附，显著降低本底噪音。

（2）rBSA Promoter 能显著促进抗原抗体反应，增强阳性响应值，提高信噪比。

（3）和 1%BSA 系统相比，rBSA Promoter 由于降低了本底信号，因此，显著提高了检测灵敏度。

 

（三）间接法检测人血清中抗生物肽 X 抗体（ACL 化学发光平台）

摘要：为检测人血中抗生物肽 X 抗体，研究者将生物肽 X 标记在磁珠上，将待测样本与生物肽 X 磁珠反应，经洗涤后，加入鼠抗人 IgG-ABEI 作为检测抗体，反应后洗涤，测量发光值。由于生物肽 X 具有强烈的非特异吸附人血中正常 IgG 的能力，造成很高的本底噪音，以至掩盖了低浓度真阳性的信号值，严重降低了试剂的灵敏度。本文对比 BSA 和 rBSA promoter 对实验结果的影响，证实 rBSA promoter 具有出色的清除非特异背景的作用。

1、试剂材料

（1）生物肽 X-磁珠

（2）鼠抗人 IgG-ABEI 示踪物

（3）空白人血清

（4）抗生物肽 X 抗体标准品:10ng/ml; 20ng/ml;100ng/ml  

2、仪器：全自动分子发光生物免疫分析仪（rightflare60pro）

3、方法与过程

（1）分别用 1%BSA 和 rBSA promoter 工作液作为反应 buffer，用两种 buffer 各自稀释生物肽 X 磁珠、鼠抗人 IgG-ABEI、样本，上机测试。

（2）反应流程：

1）生物肽 X 磁珠+样本，反应 10 分钟

2）洗涤

3）加鼠抗人 IgG-ABEI，反应 5 分钟

4）洗涤

5）读发光值

4、结果

 

Indicator	1%BSAsystem(RLU)	rBSA Promoter(RLU)
Blank(normal serum mixture）	13081	886
10ng/ml pos S/blank	14214 1.08	1648 1.86
20ng/ml pos S/blank	14256 1.08	2966 3.34
100ng/ml pos S/blank	16512 1.26	14500 16

5、小结

（1）间接法检测人血样本实验中，rBSA Promoter 能高效去除人血中正常 IgG 的非特异性吸附，显著降低本底噪音。

（2）和 1%BSA 系统相比，rBSA Promoter 由于降低了本底信号，因此，显著提高了检测灵敏度。

 

（四）双抗体夹心法检测人血清中纳米抗体（ACL 化学发光平台）

1、试剂材料

（1）SA-磁珠

（2）生物素化 capture 抗纳米抗体：captureAb-biotin

（3）detection 抗纳米抗体-ABEI 示踪物:detectionAb-ABEI

（4）空白人血清

（5）纳米抗体标准品:0.05ng/ml;0.1ng/ml;25ng/ml;50ng/ml

2、仪器：全自动分子发光生物免疫分析仪（rightflare60pro）

3、方法与过程

（1）分别用 1%BSA 和 rBSA promoter 工作液作为反应 buffer，用两种 buffer 分别稀释 SA 磁珠、captureAb-biotin、detectionAb-ABEI、样本，上机测试。

（2）反应流程：

1）SA-磁珠+样本+ captureAb-biotin，反应 10 分钟

2）洗涤

3）detectionAb-ABEI，反应 5 分钟

4）洗涤

5）读发光值

4、结果

 

Indicator	1%BSAsystem(RLU)	rBSA Promoter(RLU)
Blank(normal serum mixture）	398	357
0.05ng/ml pos S/blank	420 1.05	1071 3.00
0.1ng/ml pos S/blank	567 1.42	1713 4.79
25ng/ml pos S/blank	267812 672	428500 1200
50ng/ml pos S/blank	334765 841	682008 1910

5、小结

（1）在亲和素生物素参与的双抗体夹心法检测人血样本实验中，rBSA Promoter 能显著促进抗原抗体反应，增强阳性响应值，提高信噪比。

（2）rBSA Promoter 能明显提升检测方法的线性范围。

（3）rBSA Promoter 能显著降低检测下限，提高灵敏度。

 

（五）双抗体夹心法检测猴血中人源化双抗药（ACL 化学发光平台）

1、试剂材料

（1）鼠抗人 IgG-Fc 磁珠

（2）羊抗人 IgG-ABEI 示踪物

（3）空白猴血清

（4）人源化双特异抗体药标准品:0.5ng/ml; 1ng/ml;20ng/ml

2、仪器：全自动分子发光生物免疫分析仪（rightflare60pro）

3、方法与过程

（1）分别用 1%BSA 和 rBSA promoter 工作液作为反应 buffer，用两种 buffer 分别稀释鼠抗人 IgG-Fc 磁珠、羊抗人 IgG-ABEI 示踪物、样本，上机测试。

（2）反应流程：

1）鼠抗人 IgG-Fc 磁珠+样本，反应 10 分钟

2）洗涤

3）加羊抗人 IgG-ABEI 示踪物，反应 5 分钟

4）洗涤

5）读发光值

4、结果

 

Indicator	1%BSAsystem(RLU)	rBSA Promoter(RLU)
Blank(normal serum mixture）	1628	569
0.5ng/ml pos S/blank	1619 0.99	910 1.59
1ng/ml pos S/blank	1705 1.05	1639 2.88
20ng/ml pos S/blank	37109 22.79	36108 63.45

5、小结

（1）和 BSA 相比，在双抗体夹心法检测猴血中双抗药实验中，rBSA Promoter 能高效降低非特异性吸附，显著降低本底噪音。

（2）rBSA Promoter 能提高信噪比，和 BSA 体系相比，显著提升了检测灵敏度。

 

（六）BSA 体系和 rBSA promoter 体系低端质控准确度对比

摘要：在免疫检测定量分析中，由于标曲低浓度点和质控低浓度点信号值低且精密性较差，导致低端质控点回算时，准确度较差。rBSA promoter 体系能够大幅提升信噪比，稳定低浓度样品信号值，从而提升低值质控的准确度。

 

1、  双抗体夹心法检测人血清中纳米抗体低值质控的准确度对比（ACL 化学发光法）

反应体系	质控品真实浓度	质控品信号值复孔 CV	质控品回算浓度	准确度
1%BSA 体系	100pg/ml	14%	81	81%
rBSApromoter 体系	100pg/ml	7%	92	92%

 

2、  双抗体夹心法检测人血浆中治疗性多肽疫苗低值质控确度对比（ACL 化学发光法）

反应体系	质控品真实浓度	质控品信号值复孔 CV	质控品回算浓度	准确度
1%BSA 体系	2ng/ml	13%	1.65ng/ml	82%
rBSApromoter 体系	2ng/ml	8%	1.86ng/ml	93%

 

3、  双抗体夹心法检测人血清中 IL-6 低值质控准确度对比

反应体系	质控品真实浓度	质控品信号值复孔 CV	质控品回算浓度	准确度
1%BSA 体系	20pg/ml	14%	16.7pg/ml	83%
rBSApromoter 体系	20pg/ml	8%	21pg/ml	105%

结论：rBSA promoter 体系能提高低值质控品的准确度，降低分析批报废率。

 

（七）间接法检测人血清中抗 VEGF 抗体（ELISA 平台）

1、试剂材料

（1）VEGF Ag 包被板（costar plate）

（2）1%BSA buffer; rBSA promoter buffer

（3）羊抗人 IgG-HRP 酶结合物

（4）空白人血清

（5）抗 VEGF 标准品:2ng/ml  

（6）TMB 显色剂

（7）终止剂

2、仪器：Multiskan FC

3、方法与过程

（1）分别用 10% 胎牛血清（10%FCS）、1%BSA 和 rBSA promoter 工作液作为样品稀释液，稀释空白人血清和标准品，封闭液和酶稀释液用 1%BSA。对比三者的本底及阳性响应值。

（2）反应流程：

1）样本 1：10 稀释后，加入 VEGF Ag 包被板，室温反应 120 分钟

2）洗涤

3）加入羊抗人 IgG-HRP 酶结合物，室温反应 120 分钟

4）洗涤

5）加入显色剂，室温避光反应 10 分钟，终止后酶标仪读值

4、结果

 

Indicator	10%FCS Sample-dilution    (Abs)	1%BSA Sample-dilution    (Abs)	rBSA Promoter Sample-dilution (Abs)
Blank(normal serum mixture）	0.196	0.209	0.052
2ng/ml pos	0.232	0.306	0.356
POS/blank	1.18	1.46	6.85

 

5、小结

（1）在间接法检测人血清中抗 VEGF 抗体的 ELISA 实验中，和常用的 10%FCS、1%BSA 相比，rBSA Promoter 用作样品稀释液，能高效去除人血中正常 IgG 的非特异性吸附，显著降低本底噪音。

（2）rBSA Promoter 能促进抗原抗体反应，增加阳性响应值。

（3）rBSA Promoter 用作样品稀释液，其阳性标准品与阴性血清的信号比值分别是 1%BSA、10%FCS 的 4.7 倍、5.8 倍，能显著提升试剂的分析灵敏度。

 

发表者：北京新艾进生物科技有限公司

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